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    PCR擴(kuò)增出現(xiàn)非特異性條帶情況解讀
  • 發(fā)布日期:2025-03-31      瀏覽次數(shù):160
    • 實(shí)驗(yàn)方法原理:

      ①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備;

      ②模板DNA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;

      ③引物的延伸:DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

      重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈",而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘, 2~3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

      典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個(gè)步驟,通過(guò)將這一套過(guò)程不斷循環(huán),使DNA得以成百萬(wàn)倍的擴(kuò)增。

      PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn),其原因:

      一是引物與靶序列不全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。

      二是Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低,及PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來(lái)源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來(lái)源的酶則不出現(xiàn),酶量過(guò)多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。

      其對(duì)策有:

      ①必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引物。

      ②減低酶量或調(diào)換另一來(lái)源的酶。

      ③降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。

      ④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。

      出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶:

      PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過(guò)高,Mg2+濃度過(guò)高,退火溫度過(guò)低,循環(huán)次數(shù)過(guò)多引起。

      其對(duì)策有:

      ①減少酶量,或調(diào)換另一來(lái)源的酶。

      ②減少dNTP的濃度。

      ③適當(dāng)降低Mg2+濃度。

      ④增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。


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